Javascript ამჟამად გამორთულია თქვენს ბრაუზერში.როდესაც Javascript გამორთულია, ამ ვებსაიტის ზოგიერთი ფუნქცია არ იმუშავებს.
ხავიერ ფიდალგო, * პიერ-ანტუან დეგლესნე, * როდრიგო აროიო, * ლილიან სეპულვედა, * ევგენია რანევა, ფილიპ დეპრეზის მეცნიერების დეპარტამენტი, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empuries, კატალონია, ესპანეთი * ამ ავტორებს აქვთ გარკვეული შეხედულებები ამ ნაშრომზე. წვლილის ფონი: ჰიალურონის მჟავა (HA) არის ბუნებრივი პოლისაქარიდი, რომელიც გამოიყენება ესთეტიკური მიზნებისთვის კანის შემავსებლების წარმოებაში.იმის გამო, რომ მას აქვს რამდენიმე დღის ნახევარგამოყოფის პერიოდი ადამიანის ქსოვილებში, HA-ზე დაფუძნებული კანის შემავსებლები ქიმიურად მოდიფიცირებულია, რათა გაახანგრძლივოს მათი სიცოცხლე სხეულში.კომერციულ HA-ზე დაფუძნებულ შემავსებლებში ყველაზე გავრცელებული მოდიფიკაცია არის 1,4-ბუტანედიოლ დიგლიციდილეთერის (BDDE) გამოყენება, როგორც ჯვარედინი აგენტი HA ჯაჭვების ჯვარედინი დასაკავშირებლად.ნარჩენი ან ურეაქციო BDDE ითვლება არატოქსიკურად <2 ნაწილი მილიონზე (ppm);ამიტომ, ნარჩენი BDDE საბოლოო დერმალურ შემავსებელში რაოდენობრივად უნდა შეფასდეს პაციენტის უსაფრთხოების უზრუნველსაყოფად.მასალები და მეთოდები: ეს კვლევა აღწერს BDDE-სა და HA-ს შორის ჯვარედინი კავშირის რეაქციის ქვეპროდუქტის აღმოჩენას და დახასიათებას ტუტე პირობებში თხევადი ქრომატოგრაფიისა და მასის სპექტრომეტრიის (LC-MS) კომბინირებით.შედეგები: სხვადასხვა ანალიზის შემდეგ აღმოჩნდა, რომ ტუტე პირობები და მაღალი ტემპერატურა, რომელიც გამოიყენება HA-BDDE ჰიდროგელის დეზინფექციისთვის, ხელს უწყობს ამ ახალი ქვეპროდუქტის, „პროპილენგლიკოლის მსგავსი“ ნაერთის წარმოქმნას.LC-MS ანალიზმა დაადასტურა, რომ ქვეპროდუქტს აქვს იგივე მონოიზოტოპური მასა, როგორც BDDE, განსხვავებული შეკავების დრო (tR) და ულტრაიისფერი შთანთქმის განსხვავებული რეჟიმი (λ=200 ნმ).BDDE-სგან განსხვავებით, LC-MS ანალიზში დაფიქსირდა, რომ იმავე გაზომვის პირობებში, ამ ქვეპროდუქტს აქვს უფრო მაღალი გამოვლენის სიჩქარე 200 ნმ.დასკვნა: ეს შედეგები მიუთითებს, რომ არ არის ეპოქსიდი ამ ახალი ნაერთის სტრუქტურაში.დისკუსია ღიაა ამ ახალი ქვეპროდუქტის რისკის შესაფასებლად, რომელიც ნაპოვნია HA-BDDE ჰიდროგელის (HA კანის შემავსებლის) წარმოებაში კომერციული მიზნებისთვის.საკვანძო სიტყვები: ჰიალურონის მჟავა, HA კანის შემავსებელი, ჯვარედინი ჰიალურონის მჟავა, BDDE, LC-MS ანალიზი, BDDE სუბპროდუქტი.
ჰიალურონის მჟავაზე (HA) დაფუძნებული შემავსებლები ყველაზე გავრცელებული და პოპულარული კანის შემავსებლებია, რომლებიც გამოიყენება კოსმეტიკური მიზნებისთვის.1 ეს დერმალური შემავსებელი არის ჰიდროგელი, რომელიც ჩვეულებრივ შედგება >95% წყლისა და 0.5-3% HA, რაც მათ გელის მსგავს სტრუქტურას აძლევს.2 HA არის პოლისაქარიდი და ხერხემლიანთა უჯრედგარე მატრიქსის მთავარი კომპონენტი.ერთ-ერთი ინგრედიენტი.იგი შედგება (1,4)-გლუკურონის მჟავა-β (1,3)-N-აცეტილგლუკოზამინი (GlcNAc) განმეორებადი დისაქარიდის ერთეულებისგან, რომლებიც დაკავშირებულია გლიკოზიდური ბმებით.ეს დისაქარიდის ნიმუში ყველა ორგანიზმში ერთნაირია.ზოგიერთ ცილაზე დაფუძნებულ შემავსებელთან (როგორიცაა კოლაგენი) შედარებით, ეს თვისება HA-ს უაღრესად ბიოთავსებად მოლეკულად აქცევს.ამ შემავსებლებს შეუძლიათ გამოიჩინონ ამინომჟავების თანმიმდევრობის სპეციფიკა, რომელიც შეიძლება აღიარებული იყოს პაციენტის იმუნური სისტემის მიერ.
როდესაც გამოიყენება როგორც კანის შემავსებელი, HA-ს მთავარი შეზღუდვა არის მისი სწრაფი ბრუნვა ქსოვილებში, ფერმენტების სპეციფიკური ოჯახის არსებობის გამო, რომელსაც ეწოდება ჰიალურონიდაზები.აქამდე აღწერილია HA-ს სტრუქტურაში რამდენიმე ქიმიური მოდიფიკაცია ქსოვილებში HA-ს ნახევარგამოყოფის პერიოდის გაზრდის მიზნით.3 ამ ცვლილებების უმეტესობა ცდილობს შეამციროს ჰიალურონიდაზას წვდომა პოლისაქარიდულ პოლიმერებზე HA ჯაჭვების ჯვარედინი დაკავშირებით.ამიტომ, HA-ს სტრუქტურასა და ჯვარედინი დამაკავშირებელ აგენტს შორის ხიდების ფორმირებისა და ინტერმოლეკულური კოვალენტური ბმების გამო, ჯვარედინი HA ჰიდროგელი წარმოქმნის უფრო მეტ ანტიფერმენტული დეგრადაციის პროდუქტს, ვიდრე ბუნებრივი HA.4-6
ჯერჯერობით, ჯვარედინი HA წარმოებისთვის გამოყენებული ქიმიური ჯვარედინი აგენტები მოიცავს მეტაკრილამიდს, 7 ჰიდრაზიდს, 8 კარბოდიიმიდს, 9 დივინილ სულფონს, 1,4-ბუტანედიოლ დიგლიციდილეთერს (BDDE) და პოლი(ეთილენ გლიკოლს) დიგლიციდილეთერს.10,11 BDDE ამჟამად არის ყველაზე ხშირად გამოყენებული ჯვარედინი დამაკავშირებელი აგენტი.მიუხედავად იმისა, რომ ამ ტიპის ჰიდროგელები ათწლეულების განმავლობაში დადასტურდა, რომ უსაფრთხოა, გამოყენებული ჯვარედინი აგენტები არის რეაქტიული რეაგენტები, რომლებიც შეიძლება იყოს ციტოტოქსიური და, ზოგიერთ შემთხვევაში, მუტაგენური.12 ამიტომ, მათი ნარჩენი შემცველობა საბოლოო ჰიდროგელში მაღალი უნდა იყოს.BDDE ითვლება უსაფრთხოდ, როდესაც ნარჩენი კონცენტრაცია არის 2 ნაწილად/მილიონზე ნაკლები (ppm).4
არსებობს რამდენიმე მეთოდი HA ჰიდროგელებში დაბალი ნარჩენების BDDE კონცენტრაციის, ჯვარედინი დაკავშირების ხარისხისა და ჩანაცვლების პოზიციის გამოსავლენად, როგორიცაა გაზის ქრომატოგრაფია, ზომის გამორიცხვის ქრომატოგრაფია მასობრივი სპექტრომეტრიით (MS), ბირთვული მაგნიტური რეზონანსის (NMR) ფლუორესცენციის გაზომვის მეთოდები და დიოდური მასივის დაწყვილებული მაღალი ხარისხის თხევადი ქრომატოგრაფია (HPLC).13-17 ეს კვლევა აღწერს ქვეპროდუქტის აღმოჩენას და დახასიათებას საბოლოო ჯვარედინი HA ჰიდროგელში, რომელიც წარმოიქმნება BDDE და HA რეაქციის შედეგად ტუტე პირობებში.HPLC და თხევადი ქრომატოგრაფია-მასპექტრომეტრია (LC-MS ანალიზი).ვინაიდან BDDE-ს ამ ქვეპროდუქტის ტოქსიკურობა უცნობია, ჩვენ გირჩევთ, რომ მისი ნარჩენების რაოდენობრივი განსაზღვრა უნდა განისაზღვროს იმ მეთოდით, როგორც ჩვეულებრივ შესრულებულია BDDE-ზე საბოლოო პროდუქტში.
HA-ს (Shiseido Co., Ltd., ტოკიო, იაპონია) მიღებულ ნატრიუმის მარილს აქვს მოლეკულური წონა ~ 1,368,000 Da (Laurent მეთოდი) 18 და შინაგანი სიბლანტე 2,20 მ3/კგ.ჯვარედინი კავშირის რეაქციისთვის, BDDE (≥95%) შეძენილი იყო Sigma-Aldrich Co.-დან (სენტ-ლუი, MO, აშშ).ფოსფატის ბუფერული ფიზიოლოგიური ხსნარი pH 7.4 შეძენილი იქნა Sigma-Aldrich Company-სგან.LC-MS ანალიზში გამოყენებული ყველა გამხსნელი, აცეტონიტრილი და წყალი შეძენილი იყო HPLC ხარისხის ხარისხისგან.ჭიანჭველა მჟავა (98%) შეძენილია რეაგენტის ხარისხის სახით.
ყველა ექსპერიმენტი ჩატარდა UPLC Acquity სისტემაზე (Waters, Milford, MA, USA) და დაკავშირებული იყო API 3000 სამმაგი ოთხპოლუსიანი მასის სპექტრომეტრთან, რომელიც აღჭურვილი იყო ელექტროსპრეის იონიზაციის წყაროთ (AB SCIEX, Framingham, MA, აშშ).
ჯვარედინი HA ჰიდროგელების სინთეზი დაიწყო 198 მგ BDDE-ის დამატებით 10% (w/w) ნატრიუმის ჰიალურონატის (NaHA) ხსნარში 1% ტუტეს (ნატრიუმის ჰიდროქსიდი, NaOH) თანდასწრებით.BDDE-ს საბოლოო კონცენტრაცია სარეაქციო ნარევში იყო 9,9 მგ/მლ (0,049 მმ).შემდეგ, სარეაქციო ნარევი საფუძვლიანად შერეული და ჰომოგენიზირებული იყო და 4 საათის განმავლობაში 45°C-ზე გააჩერეს.19 რეაქციის pH შენარჩუნებულია ~12-ზე.
ამის შემდეგ, რეაქციის ნარევი გარეცხილი იყო წყლით და საბოლოო HA-BDDE ჰიდროგელი გაფილტრული და განზავებული იყო PBS ბუფერით, რათა მიაღწიოს HA კონცენტრაციას 10-დან 25 მგ/მლ-მდე და საბოლოო pH 7.4-მდე.წარმოებული ჯვარედინი HA ჰიდროგელების სტერილიზაციის მიზნით, ყველა ეს ჰიდროგელი ავტოკლავდება (120°C 20 წუთის განმავლობაში).გაწმენდილი BDDE-HA ჰიდროგელი ინახება 4°C-ზე ანალიზამდე.
ჯვარედინი დაკავშირებულ HA პროდუქტში არსებული BDDE-ის გასაანალიზებლად, 240 მგ ნიმუში აიწონეს და შეიყვანეს ცენტრალურ ხვრელში (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, აშშ; მოცულობა 0.5 მლ) და ცენტრიფუგირებულ იქნა 10000 rpm-ზე ოთახის ტემპერატურაზე. 10 წუთი.სულ 20 μL ჩამოსაშლელი სითხე შეგროვდა და გაანალიზდა.
BDDE სტანდარტის (Sigma-Aldrich Co) ანალიზისთვის ტუტე პირობებში (1%, 0.1% და 0.01% NaOH), თუ შემდეგი პირობები დაკმაყოფილებულია, თხევადი ნიმუში არის 1:10, 1:100 ან მდე. 1:1,000,000 საჭიროების შემთხვევაში გამოიყენეთ MilliQ დეიონირებული წყალი ანალიზისთვის.
ჯვარედინი კავშირის რეაქციაში გამოყენებული საწყისი მასალებისთვის (HA 2%, H2O, 1% NaOH და 0.049 მმ BDDE), ამ მასალებისგან მომზადებული თითოეული ნიმუშის 1 მლ გაანალიზდა იგივე საანალიზო პირობების გამოყენებით.
იონურ რუკაზე გამოსახული პიკების სპეციფიკის დასადგენად, 20 μL ნიმუშს დაემატა 10 μL 100 ppb BDDE სტანდარტული ხსნარი (Sigma-Aldrich Co).ამ შემთხვევაში, სტანდარტის საბოლოო კონცენტრაცია თითოეულ ნიმუშში არის 37 ppb.
პირველ რიგში, მოამზადეთ BDDE საფონდო ხსნარი კონცენტრაციით 11,000 მგ/ლ (11,000 ppm) 10 μL სტანდარტული BDDE (Sigma-Aldrich Co) 990 μL MilliQ წყლით (სიმკვრივე 1,1 გ/მლ) განზავებით.გამოიყენეთ ეს ხსნარი 110 მკგ/ლ (110 ppb) BDDE ხსნარის მოსამზადებლად, როგორც შუალედური სტანდარტული განზავება.შემდეგ გამოიყენეთ შუალედური BDDE სტანდარტული გამხსნელი (110 ppb) სტანდარტული მრუდის მოსამზადებლად შუალედური გამხსნელის რამდენჯერმე განზავებით, რათა მიაღწიოთ სასურველ კონცენტრაციას 75, 50, 25, 10 და 1 ppb.როგორც 1-ლ სურათზეა ნაჩვენები, აღმოჩნდა, რომ BDDE სტანდარტულ მრუდს 1.1-დან 110 ppb-მდე აქვს კარგი წრფივობა (R2>0.99).სტანდარტული მრუდი განმეორდა ოთხ დამოუკიდებელ ექსპერიმენტში.
სურათი 1 BDDE სტანდარტული კალიბრაციის მრუდი, მიღებული LC-MS ანალიზით, რომელშიც შეინიშნება კარგი კორელაცია (R2>0.99).
აბრევიატურები: BDDE, 1,4-ბუტანედიოლ დიგლიციდილეთერი;LC-MS, თხევადი ქრომატოგრაფია და მასის სპექტრომეტრია.
ჯვარედინი HA-ში არსებული BDDE სტანდარტების და ბაზის ხსნარში არსებული BDDE სტანდარტების იდენტიფიკაციისა და რაოდენობრივი განსაზღვრის მიზნით, გამოყენებული იქნა LC-MS ანალიზი.
ქრომატოგრაფიული განცალკევება მიღწეული იყო LUNA 2.5 μm C18(2)-HST სვეტზე (50×2.0 მმ2; Phenomenex, Torrance, CA, აშშ) და ინახება ოთახის ტემპერატურაზე (25°C) ანალიზის დროს.მობილური ფაზა შედგება აცეტონიტრილის (გამხსნელი A) და წყლის (გამხსნელი B)გან, რომელიც შეიცავს 0,1% ჭიანჭველას.მობილური ფაზა გამოირეცხება გრადიენტური გამორეცხვით.გრადიენტი ასეთია: 0 წუთი, 2% A;1 წუთი, 2% A;6 წუთი, 98% A;7 წუთი, 98% A;7.1 წუთი, 2% A;10 წუთი, 2% A. მუშაობის ხანგრძლივობაა 10 წუთი და ინექციის მოცულობა 20 μL.BDDE-ის შეკავების დრო დაახლოებით 3.48 წუთია (ექსპერიმენტების მიხედვით 3.43-დან 4.14 წუთამდე მერყეობს).მობილური ფაზა გადატუმბული იყო 0.25 მლ/წთ ნაკადის სიჩქარით LC-MS ანალიზისთვის.
BDDE ანალიზისა და MS-ით რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის, UPLC სისტემა (Waters) შერწყმულია API 3000 სამმაგი ოთხპოლუსიანი მასის სპექტრომეტრით (AB SCIEX), რომელიც აღჭურვილია ელექტროსპრეის იონიზაციის წყაროთ, და ანალიზი ხორციელდება დადებითი იონის რეჟიმში (ESI+).
BDDE-ზე ჩატარებული იონური ფრაგმენტის ანალიზის მიხედვით, ყველაზე მაღალი ინტენსივობის ფრაგმენტი დადგინდა, რომ იყო ფრაგმენტი, რომელიც შეესაბამება 129.1 Da-ს (სურათი 6).მაშასადამე, რაოდენობრივად განსაზღვრისთვის მრავალიონური მონიტორინგის რეჟიმში (MIM), BDDE-ის მასის კონვერტაცია (მასა-დამუხტვის თანაფარდობა [მ/ზ]) არის 203.3/129.1 და.ის ასევე იყენებს სრული სკანირების (FS) რეჟიმს და პროდუქტის იონის სკანირების (PIS) რეჟიმს LC-MS ანალიზისთვის.
მეთოდის სპეციფიკის გადამოწმების მიზნით, გაანალიზდა ცარიელი ნიმუში (საწყისი მობილური ფაზა).არ იყო გამოვლენილი სიგნალი ცარიელ ნიმუშში მასის კონვერტაციით 203.3/129.1 და.ექსპერიმენტის განმეორებადობასთან დაკავშირებით, გაანალიზდა 10 სტანდარტული ინექცია 55 ppb (კალიბრაციის მრუდის შუაში), რის შედეგადაც იყო ნარჩენი სტანდარტული გადახრა (RSD) <5% (მონაცემები არ არის ნაჩვენები).
ნარჩენი BDDE შემცველობა რაოდენობრივი იყო რვა სხვადასხვა ავტოკლავირებულ BDDE ჯვარედინი დაკავშირებულ HA ჰიდროგელში, რაც შეესაბამება ოთხ დამოუკიდებელ ექსპერიმენტს.როგორც აღწერილია განყოფილებაში „მასალები და მეთოდები“, რაოდენობრივი შეფასება ფასდება BDDE სტანდარტული განზავების რეგრესიის მრუდის საშუალო მნიშვნელობით, რომელიც შეესაბამება უნიკალურ პიკს, რომელიც გამოვლენილია BDDE მასის გადასვლაზე 203.3/129.1 Da, შეკავებით. დრო 3.43-დან 4.14 წუთამდე არ ელოდება.სურათი 2 გვიჩვენებს 10 ppb BDDE საცნობარო სტანდარტის ქრომატოგრამის მაგალითს.ცხრილი 1 აჯამებს რვა სხვადასხვა ჰიდროგელის ნარჩენი BDDE შემცველობას.მნიშვნელობის დიაპაზონი არის 1-დან 2,46 ppb-მდე.ამიტომ, ნარჩენი BDDE კონცენტრაცია ნიმუშში მისაღებია ადამიანის გამოყენებისთვის (<2 ppm).
სურათი 2 10 ppb BDDE საცნობარო სტანდარტის იონური ქრომატოგრამა (Sigma-Aldrich Co), MS (მ/ზ) გადასვლა, მიღებული LC-MS ანალიზით 203.30/129.10 Da (დადებითი MRM რეჟიმში).
აბრევიატურები: BDDE, 1,4-ბუტანედიოლ დიგლიციდილეთერი;LC-MS, თხევადი ქრომატოგრაფია და მასის სპექტრომეტრია;MRM, მრავალჯერადი რეაქციის მონიტორინგი;MS, მასა;მ/ზ, მასა-დამუხტვის თანაფარდობა.
შენიშვნა: ნიმუშები 1-8 არის ავტოკლავირებული BDDE ჯვარედინი HA ჰიდროგელი.ასევე მოხსენებულია BDDE-ს ნარჩენი რაოდენობა ჰიდროგელში და BDDE შეკავების დროის პიკი.და ბოლოს, ასევე მოხსენებულია ახალი მწვერვალების არსებობა სხვადასხვა შეკავების დროით.
აბრევიატურები: BDDE, 1,4-ბუტანედიოლ დიგლიციდილეთერი;HA, ჰიალურონის მჟავა;MRM, მრავალჯერადი რეაქციის მონიტორინგი;tR, შეკავების დრო;LC-MS, თხევადი ქრომატოგრაფია და მასის სპექტრომეტრია;RRT, შედარებითი შეკავების დრო.
გასაკვირია, რომ LC-MS იონური ქრომატოგრამის ანალიზმა აჩვენა, რომ ყველა ავტოკლავირებული ჯვარედინი HA ჰიდროგელის ანალიზის ნიმუშებზე დაყრდნობით, იყო დამატებითი პიკი უფრო მოკლე შეკავების დროს 2.73-დან 3.29 წუთამდე.მაგალითად, სურათი 3 გვიჩვენებს ჯვარედინი HA ნიმუშის იონურ ქრომატოგრამას, სადაც დამატებითი პიკი ჩნდება სხვადასხვა შეკავების დროს, დაახლოებით 2,71 წუთის განმავლობაში.დაკვირვებული ფარდობითი შეკავების დრო (RRT) ახლად დაკვირვებულ პიკსა და BDDE-დან პიკს შორის აღმოჩნდა 0,79 (ცხრილი 1).ვინაიდან ჩვენ ვიცით, რომ ახლად დაფიქსირებული პიკი ნაკლებად არის შენარჩუნებული C18 სვეტში, რომელიც გამოიყენება LC-MS ანალიზში, ახალი პიკი შეიძლება შეესაბამებოდეს უფრო პოლარულ ნაერთს, ვიდრე BDDE.
სურათი 3 LC-MS-ით მიღებული ჯვარედინი HA ჰიდროგელის ნიმუშის იონური ქრომატოგრამა (MRM მასის კონვერტაცია 203.3/129.0 Da).
აბრევიატურები: HA, ჰიალურონის მჟავა;LC-MS, თხევადი ქრომატოგრაფია და მასის სპექტრომეტრია;MRM, მრავალჯერადი რეაქციის მონიტორინგი;RRT, შედარებითი შეკავების დრო;tR, შეკავების დრო.
იმისათვის, რომ გამოირიცხოს შესაძლებლობა, რომ დაფიქსირებული ახალი მწვერვალები იყოს დამაბინძურებლები თავდაპირველად გამოყენებული ნედლეულში, ეს ნედლეული ასევე გაანალიზდა იგივე LC-MS ანალიზის მეთოდის გამოყენებით.გაანალიზებული საწყისი მასალები მოიცავს წყალს, 2% NaHA წყალში, 1% NaOH წყალში და BDDE იმავე კონცენტრაციით, რომელიც გამოიყენება ჯვარედინი კავშირის რეაქციაში.გამოყენებული საწყისი მასალის იონური ქრომატოგრამა არ აჩვენებდა რაიმე ნაერთს ან პიკს და მისი შეკავების დრო შეესაბამება ახალ დაკვირვებულ პიკს.ეს ფაქტი უარყოფს იმ აზრს, რომ არა მხოლოდ საწყისი მასალა შეიძლება შეიცავდეს ნაერთებს ან ნივთიერებებს, რომლებმაც შეიძლება ხელი შეუშალონ ანალიზის პროცედურას, მაგრამ არ არსებობს სხვა ლაბორატორიულ პროდუქტებთან შესაძლო ჯვარედინი დაბინძურების ნიშანი.BDDE-სა და ახალი პიკების LC-MS ანალიზის შემდეგ მიღებული კონცენტრაციის მნიშვნელობები ნაჩვენებია ცხრილში 2 (ნიმუშები 1-4) და იონური ქრომატოგრამა 4-ზე.
შენიშვნა: ნიმუშები 1-4 შეესაბამება ნედლეულს, რომელიც გამოიყენება ავტოკლავირებული BDDE ჯვარედინი HA ჰიდროგელების წარმოებისთვის.ეს ნიმუშები არ იყო ავტოკლავირებული.
აბრევიატურები: BDDE, 1,4-ბუტანედიოლ დიგლიციდილეთერი;HA, ჰიალურონის მჟავა;LC-MS, თხევადი ქრომატოგრაფია და მასის სპექტრომეტრია;MRM, მრავალჯერადი რეაქციის მონიტორინგი.
სურათი 4 შეესაბამება ნედლეულის ნიმუშის LC-MS ქრომატოგრამას, რომელიც გამოიყენება HA და BDDE ჯვარედინი კავშირის რეაქციაში.
შენიშვნა: ყველა ეს იზომება იმავე კონცენტრაციით და თანაფარდობით, რომელიც გამოიყენება ჯვარედინი კავშირის რეაქციის განსახორციელებლად.ქრომატოგრამის მიერ გაანალიზებული ნედლეულის რიცხვები შეესაბამება: (1) წყალს, (2) 2% HA წყალხსნარს, (3) 1% NaOH წყალხსნარს.LC-MS ანალიზი ტარდება 203.30/129.10 Da-ის მასის კონვერტაციისთვის (დადებითი MRM რეჟიმში).
აბრევიატურები: BDDE, 1,4-ბუტანედიოლ დიგლიციდილეთერი;HA, ჰიალურონის მჟავა;LC-MS, თხევადი ქრომატოგრაფია და მასის სპექტრომეტრია;MRM, მრავალჯერადი რეაქციის მონიტორინგი.
შეისწავლეს პირობები, რამაც გამოიწვია ახალი მწვერვალების ჩამოყალიბება.იმის შესასწავლად, თუ როგორ მოქმედებს ჯვარედინი HA ჰიდროგელის წარმოებისთვის გამოყენებული რეაქციის პირობები BDDE ჯვარედინი დამაკავშირებელი აგენტის რეაქტიულობაზე, რაც იწვევს ახალი მწვერვალების (შესაძლო ქვეპროდუქტების) წარმოქმნას, ჩატარდა სხვადასხვა გაზომვები.ამ განსაზღვრებში ჩვენ შევისწავლეთ და გავაანალიზეთ საბოლოო BDDE კროსლინკერი, რომელიც დამუშავებული იყო NaOH-ის სხვადასხვა კონცენტრაციით (0%, 1%, 0.1% და 0.01%) წყალხსნარში, რასაც მოჰყვა ან ავტოკლავირების გარეშე.ბაქტერიების პროცედურა იგივე პირობების სიმულაციისთვის არის იგივე მეთოდი, რომელიც გამოიყენება ჯვარედინი HA ჰიდროგელის წარმოებისთვის.როგორც აღწერილია სექციაში „მასალები და მეთოდები“, ნიმუშის მასობრივი გადასვლა გაანალიზდა LC-MS-ით 203.30/129.10 და.BDDE და ახალი პიკის კონცენტრაცია გამოითვლება და შედეგები ნაჩვენებია ცხრილში 3. არ იყო გამოვლენილი ახალი პიკები იმ ნიმუშებში, რომლებიც არ იყო ავტოკლავირებული, მიუხედავად ხსნარში NaOH-ის არსებობისა (ნიმუშები 1-4, ცხრილი 3).ავტოკლავირებული ნიმუშებისთვის ახალი მწვერვალები აღმოჩენილია მხოლოდ ხსნარში NaOH-ის თანდასწრებით და პიკის ფორმირება, როგორც ჩანს, დამოკიდებულია ხსნარში NaOH-ის კონცენტრაციაზე (ნიმუშები 5-8, ცხრილი 3) (RRT = 0.79).სურათი 5 გვიჩვენებს იონური ქრომატოგრამის მაგალითს, სადაც ნაჩვენებია ორი ავტოკლავირებული ნიმუში NAOH-ის თანდასწრებით ან არარსებობით.
აბრევიატურები: BDDE, 1,4-ბუტანედიოლ დიგლიციდილეთერი;LC-MS, თხევადი ქრომატოგრაფია და მასის სპექტრომეტრია;MRM, მრავალჯერადი რეაქციის მონიტორინგი.
შენიშვნა: ზედა ქრომატოგრამა: ნიმუში დამუშავდა 0.1% NaOH წყალხსნარით და ავტოკლავირებული (120°C 20 წუთის განმავლობაში).ქვედა ქრომატოგრამა: ნიმუში არ იყო დამუშავებული NaOH-ით, არამედ ავტოკლავირებული იყო იმავე პირობებში.მასის კონვერტაცია 203.30/129.10 Da (დადებითი MRM რეჟიმში) გაანალიზდა LC-MS-ით.
აბრევიატურები: BDDE, 1,4-ბუტანედიოლ დიგლიციდილეთერი;LC-MS, თხევადი ქრომატოგრაფია და მასის სპექტრომეტრია;MRM, მრავალჯერადი რეაქციის მონიტორინგი.
ყველა ავტოკლავირებულ ნიმუშში, NaOH-ით ან მის გარეშე, BDDE კონცენტრაცია მნიშვნელოვნად შემცირდა (16.6-ჯერ) (ნიმუშები 5-8, ცხრილი 2).BDDE კონცენტრაციის დაქვეითება შეიძლება გამოწვეული იყოს იმით, რომ მაღალ ტემპერატურაზე წყალს შეუძლია იმოქმედოს როგორც ბაზის (ნუკლეოფილი) BDDE-ს ეპოქსიდური რგოლის გასახსნელად 1,2-დიოლის ნაერთის წარმოქმნით.ამ ნაერთის მონოიზოტოპური ხარისხი განსხვავდება BDDE-ისგან და, შესაბამისად, გავლენას არ მოახდენს.LC-MS-მა გამოავლინა მასობრივი ცვლა 203.30/129.10 და.
საბოლოოდ, ეს ექსპერიმენტები აჩვენებს, რომ ახალი მწვერვალების წარმოქმნა დამოკიდებულია BDDE, NAOH და ავტოკლავირების პროცესზე, მაგრამ არაფერი აქვს საერთო HA-სთან.
ახალი პიკი, რომელიც ნაპოვნი იქნა დაახლოებით 2.71 წუთის შეკავების დროს, შემდეგ ხასიათდებოდა LC-MS-ით.ამ მიზნით, BDDE (9.9 მგ/მლ) ინკუბირებული იყო 1% NaOH წყალხსნარში და ავტოკლავირებული იყო.ცხრილში 4, ახალი პიკის მახასიათებლები შედარებულია ცნობილ BDDE საცნობარო პიკთან (შეკავების დრო დაახლოებით 3.47 წუთი).ორი პიკის იონური ფრაგმენტაციის ანალიზზე დაყრდნობით, შეიძლება დავასკვნათ, რომ პიკი შეკავების დროით 2,72 წუთი აჩვენებს იგივე ფრაგმენტებს, როგორც BDDE პიკი, მაგრამ განსხვავებული ინტენსივობით (სურათი 6).მწვერვალისთვის, რომელიც შეესაბამება შეკავების დროს (PIS) 2.72 წუთს, უფრო ინტენსიური პიკი დაფიქსირდა ფრაგმენტაციის შემდეგ 147 Da მასაზე.BDDE-ს კონცენტრაციაზე (9.9 მგ/მლ), რომელიც გამოიყენება ამ განსაზღვრაში, ასევე დაფიქსირდა შთანთქმის სხვადასხვა რეჟიმი (UV, λ=200 ნმ) ულტრაიისფერ სპექტრში ქრომატოგრაფიული გამოყოფის შემდეგ (სურათი 7).პიკი შეკავების დროით 2,71 წუთი კვლავ ჩანს 200 ნმ-ზე, ხოლო BDDE პიკი არ შეიძლება შეინიშნოს ქრომატოგრამაში იმავე პირობებში.
ცხრილი 4 ახალი პიკის დახასიათების შედეგები შეკავების დროით დაახლოებით 2,71 წუთი და BDDE პიკი შეკავების დროით 3,47 წუთი
შენიშვნა: ამ შედეგების მისაღებად, LC-MS და HPLC ანალიზები (MRM და PIS) ჩატარდა ორ პიკზე.HPLC ანალიზისთვის გამოიყენება UV გამოვლენა ტალღის სიგრძით 200 ნმ.
აბრევიატურები: BDDE, 1,4-ბუტანედიოლ დიგლიციდილეთერი;HPLC, მაღალი ხარისხის თხევადი ქრომატოგრაფია;LC-MS, თხევადი ქრომატოგრაფია და მასის სპექტრომეტრია;MRM, მრავალჯერადი რეაქციის მონიტორინგი;მ/ზ, მასა-დამუხტვის თანაფარდობა;PIS, პროდუქტის იონის სკანირება;ულტრაიისფერი შუქი, ულტრაიისფერი შუქი.
შენიშვნა: მასის ფრაგმენტები მიიღება LC-MS ანალიზით (PIS).ზედა ქრომატოგრამა: BDDE სტანდარტული ნიმუშის ფრაგმენტების მასის სპექტრი.ქვედა ქრომატოგრამა: აღმოჩენილი ახალი პიკის მასის სპექტრი (BDDE პიკთან დაკავშირებული RRT არის 0.79).BDDE დამუშავდა 1% NaOH ხსნარში და ავტოკლავირებული იყო.
აბრევიატურები: BDDE, 1,4-ბუტანედიოლ დიგლიციდილეთერი;LC-MS, თხევადი ქრომატოგრაფია და მასის სპექტრომეტრია;MRM, მრავალჯერადი რეაქციის მონიტორინგი;PIS, პროდუქტის იონური სკანირება;RRT, შედარებითი შეკავების დრო.
სურათი 7 203.30 Da წინამორბედი იონის იონის ქრომატოგრამა და (A) ახალი პიკი შეკავების დროით 2.71 წუთი და (B) BDDE საცნობარო სტანდარტული პიკის UV გამოვლენა 3.46 წუთში 200 ნმ.
ყველა წარმოებულ ჯვარედინი HA ჰიდროგელში, დაფიქსირდა, რომ ნარჩენი BDDE კონცენტრაცია LC-MS რაოდენობრივი განსაზღვრის შემდეგ იყო <2 ppm, მაგრამ ახალი უცნობი პიკი გამოჩნდა ანალიზში.ეს ახალი პიკი არ ემთხვევა BDDE სტანდარტულ პროდუქტს.BDDE სტანდარტის პროდუქტმა ასევე გაიარა იგივე ხარისხის კონვერტაცია (MRM კონვერტაცია 203.30/129.10 Da) ანალიზი დადებითი MRM რეჟიმში.ზოგადად, სხვა ანალიტიკური მეთოდები, როგორიცაა ქრომატოგრაფია, გამოიყენება როგორც ზღვრული ტესტები ჰიდროგელებში BDDE-ს გამოსავლენად, მაგრამ მაქსიმალური გამოვლენის ზღვარი (LOD) ოდნავ დაბალია 2 ppm-ზე.მეორეს მხრივ, ჯერჯერობით, NMR და MS გამოიყენებოდა ჯვარედინი კავშირის და/ან მოდიფიკაციის ხარისხის დასახასიათებლად HA-ს ჯვარედინი HA პროდუქტების შაქრის ერთეულ ფრაგმენტებში.ამ ტექნიკის მიზანი არასოდეს ყოფილა ნარჩენი BDDE-ის გამოვლენის რაოდენობრივი დადგენა ისეთ დაბალ კონცენტრაციებში, როგორსაც აღვწერთ ამ სტატიაში (LOD ჩვენი LC-MS მეთოდი = 10 ppb).
გამოქვეყნების დრო: სექ-01-2021